리포좀은 생체적합성이 우수, 제법이 간편하여 수용성 및 지용성 약물을 운반할 수 있는 장점이 있어 체내에서 의 부작용이 적은 약물전달체로서 연구가 활발히 진행되고 있다. 기존의 리포좀은 계 자체가 물리화학적으로 불안정하기 때문에 수용액 내에 분산시켜 보관할 때 응집, 융합, 인지질의 가수분해, 산화 및 봉입 약물의 누출 등을 야기 할 수 있는 단점을 지니고 있다.

리포솜의 물리-화학적 불안정성을 극복하기 위한 방법으로서 리포솜을 동결건조하여 미세분말화하는 방법이 연구가 진행되고 있다. 그러나 동결건조 과정에 리포좀을 단독으로는 적용 시에는 안정성과 균질성이 저해되어 물리화학적 특성이 변형됨에 따라 약물전달체로서의 기능뿐만 아니라, 면역활성의 효과 역시 부진해지고 독성이 발생하는 단점이 있다. 따라서 동결건조과정에서 리포좀의 변형을 방지하기 위하여 동결방지제등을 첨가하여 리포좀이 가지는 장점을 극대화하면서, 생산 및 보관, 운송에 유리한 조성물에 관한 연구가 진행 중이다.

리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS)는 그람 음성 박테리아의 외막의 주요 성분으로, 다양한 면역세포를 촉진시키며 특히 선천성 면역 반응을 촉발시킨다. 그러나 기존의 LPS은 독성으로 인해 사용이 어려운 문제가 있었다. 따라서 LPS의 약독화 시도가 꾸준히 진행 중에 있다.

아이진의 본 발명은 신규한 구조의 면역반응 조절물질을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 독성을 감소시킨 LPS 유사체 및 양이온성 리포좀을 포함하는 면역증강용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

아이진은 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주로부터 O-항원 부위를 갖지 않는 LOS를 분리 정제하고, 탈아실화시켜 독성이 감소된 신규한 구조의 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)을 발견하였으며, 상기 면역반응 조절물질과 양이온성 리포좀을 포함하는 백신 조성물은 우수한 면역촉진 상승효과를 나타냄을 확인하였다.

[화학식1]

본 발명의 면역반응 조절물질은 화학식1의 구조를 가진다. 화학식 1에서, C, D 및 E는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타내며, 상기 포스페이트는 당의 히드록시기 중 어느 하나에 결합되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실험예에서 EG-IM 또는 MPL(Monophosphoryl lipid A)의 당지질을 리피드 용해 단계에 혼합하여 지질혼합물 케이크를 제조하고 재수화를 통해 리포좀을 제조하였다. 또한 EG-IM 또는 MPL의 당지질을 리포좀 용액에 단순 혼합한 시료를 제조한 후 각 리포좀의 물성 분석하였다.

 [표 1] 당지질 종류 및 혼입단계에 따른 리포좀 사이즈 변화율 분석

리포좀 사이즈 변화율 분석결과, MPL(Monophosphoryl lipid A)의 경우는 농도에 의존적으로 분산도가 커지는 경향이 관찰되었다. 반면, EG-IM의 경우는 함량에 관계없이 분산도가 균일하게 유지되었다(표 1).

[표 2] 당지질 종류 및 혼입단계에 따른 리포좀 사이즈 균질도 분석

리포좀 사이즈 균질도 분석결과, MPL의 경우는 농도에 의존적으로 분산도가 커지는 경향이 관찰되었다. 반면, EG-IM의 경우는 함량에 관계없이 분산도가 균일하게 유지되었다(표 2).

[표 3] 당지질 종류 및 혼입단계에 따른 리포좀 표면전화 분석

리포좀의 표면전화 분석결과, EG-IM의 경우는 함량에 상관없이 표면 전하가 55 mV 수준으로 균일하게 유지되었다. 반면, MPL의 경우는 6 mol%로 고함량을 혼합하는 경우 표면전하가 급격하게 감소하였다(표 3).

일반적으로 양이온성 리포좀은 세포독성을 일으킨다고 알려져 있다. 이에 제조된 liposomal EG-IM의 경우 EG-IM에 의한 양이온성 리포좀의 세포독성이 완화되는 효과를 나타내는지 확인하였다. 사람 섬유아세포 MRC-5 세포를 이용해 EG-IM을 포함한 리포좀의 세포독성을 측정하였다. DDA:DMPC로 구성된 양이온성리포좀에 콜레스테롤 유무와 사이즈 균질화 방법 차이, 면역자극물질 EG-IM 유무에 따른 제조 리포좀의 세포독성을 평가하였다.

[그림1] liposomal EG-IM 의 세포독성 완화 효과를 나타내는 그래프

그림1의 A는 Cholesterol을 포함하지 않은 리포좀, B는 콜레스테롤을 포함한 리포좀, 1은 extruder를 사용하여 리포좀 균질화한 군이며, 2는 초음파파쇄기(sonicator)를 사용하여 리포좀 균질화한 군이다.

그림1을 참조하면, DDA:DMPC에 의해 농도 의존적으로 나타나는 세포독성이 EG-IM 혼합에 의해 완화되었음을 확인할 수 있다.

[그림2] liposomal EG-IM을 포함하는 대상포진 백신 투여시 IFN-γ 사이토카인 분비량

본 발명의 실험예에서 대상포진 백신에 대한 liposomal EG-IM의 면역원성 분석하였다. 그림2를 참조하면 liposomal EG-IM을 이용한 시험군은 EG-IM 단독으로 이용한 시험군에 비해 IFN-γ 분비를 증진시켰으며, 상용백신인 Zostavax 보다도 IFN-γ 분비를 증진시켰다. 따라서, liposomal EG-IM을 포함하는 대상포진 백신은 세포성 면역 유도능이 우수하다는 것을 확인하였다.

또한, 지카 백신, 일본뇌염 백신, 결핵 백신, 백일해 백신에 대한 면역원성 분석결과 역시 liposomal EG-IM을 포함하는 경우 우수함을 확인하였다.

현재 아이진은 특허를 활용해 코로나 예방 백신(EG-COVID)을 개발 중이며 현재 전임상을 진행 중으로 화이자 및 모더나의 신종 코로나바이러스 감염증(코로나19) 백신과 유사한 mRNA 기반이다. 화이자와 모더나가 초저온에서 보관 운송해야 하는 반면 아이진의 백신은 리포좀의 물리화학적 불안정성을 극복한 본 기술을 적용하여 영상 4도에서 보관ㆍ유통 가능하다.

아이진의 본 기술은 항원 및 면역반응 조절물질과 양이온성 리포좀을 모두 포함함으로써, 면역반응 조절물질을 단독으로 사용하는 경우에 비해 향상된 면역증강효능을 발휘한다. 또한, 리포좀의 물리화학적 불안정성을 극복하여, 생산, 운송 및 보관에 있어 유리할 뿐만 아니라, 안정성을 개선하여 면역전달시스템으로서 이점을 가져 백신 개발 및 상용화시 경쟁력을 확보할 수 있을 것으로 기대된다.

특허법인 ECM

변리사 최자영

jychoi@ecmpatent.com

02-568-2675

참조

[특징주] 아이진, 美 특허 취득…화이자ㆍ모더나 백신 단점 해결 기대감에 상승세, 이투데이, 2020년 11월 24일