ATF3(Activating transcription factor 3) 단백질은 전사인자의 포유동물 활성전사조절인자/cAMP 반응요소-결합 단백질(mammalian activation transcription factor/cAMP responsive element-binding(CREB)protein)의 구성성분으로, ATF3 유전자는 암 발생에 관여하는 여러 요인들에 의해 나타나는 다양한 신호들에 의해 발현이 유도되며, 세포내 스트레스 반응의 복잡한 과정에 연관되어 있는 것으로 알려져 왔다.
대식세포, 비만세포, T 세포, 수지상 세포 등의 면역세포에서뿐만 아니라 섬유아세포나 상피세포를 비롯한 대부분의 세포에서 NF-κJNK, Erk, p38, PKC 등 다양한 경로가 ATF3를 유도하고, 유도된 ATF3는 다양한 유전자들의 전사를 조절하여 세포사멸, 세포성장, 세포이동, DNA 수선, 대사에 관여하며, 그 중에 NF-κ가 관계된 염증반응 유도에도 연관성이 있다고 알려져 있다.
현재 ATF3 단백질의 발현은 염증성 질환, 비만, 당뇨 등과의 연관성에 대한 많은 연구가 진행되고 있고 ATF3 단백질의 발현 또는 기능을 조절하는 물질에 의해, ATF3에 의해 유도되는 염증반응을 억제할 수 있을 것이나, 현재까지는 ATF3 단백질에 대한 효과적인 저해제가 개발되지는 않고 있다.
나이벡의 본 발명은 염증 및 대사성 질환의 바이오마커인 ATF3 단백질에 결합할 수 있는 신규한 펩타이드에 관한 것이다.
나이벡은 본 발명에서 ATF3에 결합하여 ATF3의 발현을 억제하고, ATF3에 의한 신호전달 경로를 저해하는 펩타이드와 이를 포함하는 약제학적 조성물을 개발하여 염증유발 사이토카인 (inflammatory cytokine)의 생성을 감소시키는 것을 확인하였다.
나이벡은 ATF3에 결합하는 특정한 펩타이드 서열을 발굴하기 위하여 파지 디스플레이 방법 (Phage display)을 이용하였다. 12 개 아미노산으로 구성된 랜덤 펩타이드 라이브러리가 표지된 파지들을 이용하여 발굴한 최종 17 개 클론의 서열 분석하였다.
그 결과, 2 개의 클론이 동일한 DNA 서열을 나타내는 4개의 서열을 확인하였고 이를 번역하여 12 개 아미노산으로 구성된 최종 펩타이드의 서열로 서열번호 1 (ABP1, AESPLTNRGWNP), 서열번호 2 (ABP2 (MLDTNIQSRPNL), 서열번호 3 (ABP3, TLGLRPVPVATT), 서열번호 4 (ABP3, VLNIPEHFTAQN)를 얻었다.
서열번호 1 내지 4의 펩타이드를 합성하고, ATF3 단백질과의 결합 친화성 (Binding affinity) 확인하였다. 분석결과, 농도 의존적으로 ATF3 단백질에 결합하는 경향을 확인하였다(그림1).
[그림1] ATF3 단백질과의 결합 친화성 확인
ATF3 단백질에 결합능이 있는 서열번호 1 내지 4의 펩타이드의 C말단에 서열번호 5의 펩타이드를 연결하여 서열번호 6 내지 9의 펩타이드를 합성하였다.
형광으로 표지된 서열번호1, 5, 6의 펜타이드를 RAW 264.7세포에 처리한 후 공초점 현미경으로 관찰한 결과, 서열번호 1의 펩타이드는 세포 내에서 약하게 붉은 색의 형광이 관찰된 되어 일부가 투과된 것을 확인하였다. 서열번호 5와 서열번호 6의 펩타이드는 서열 번호 1의 펩타이드보다 형광이 세포내에서 많이 관찰되어 세포 투과성이 높음을 확인할 수 있었다(그림2).
[그림2] 세포투과 정도를 관찰한 공초첨 현미경 사진
이는, 세포투과성이 낮은 서열번호 1의 펩타이드에 세포투과성이 높은 서열번호 5의 펩타이드를 결합시킴으로써(즉, 서열번호 6) ATF3 단백질에 결합력이 있는 펩타이드의 세포내 투과능을 더 증가시켜 세포 안에서 그 효과를 증가시킬 수 있음을 의미한다.
ATF3 결합 펩타이드에 의한 IL-6의 발현 감소 효과 확인하고자, HepG2 세포에 서열번호 1 내지 6의 펩타이드를 2시간 처리한 후, 팔미트산(palmitic acid)을 200μM 농도로 처리하여 24시간 동안 염증 반응을 유도하였다. 각각의 배지를 수거하여 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현정도를 ELISA 분석하였다.
분석결과, 팔미트산에 의해 증가된 IL-6의 발현량이 ATF3 결합 펩타이드에 의해 감소되었음을 확인할 수 있었다. 이는 ATF3 결합 펩타이드가 염증 유발 사이토카인의 생성을 감소시킴으로써 간질환 치료효과가 있다는 것을 증명하는 것이다. 또한, 서열번호 6은 IL-6의 발현량이 가장 감소한 것으로 보아, 서열번호 5의 세포투과능에 의해서 사이토카인의 발현억제 효과가 더욱 증가하였음을 알 수 있었다(그림3).
[그림3] ATF3 결합 펩타이드에 의한 IL-6의 발현 감소 효과 분석
또한 비알콜성 지방간염 동물모델에서 펩타이드의 효과를 확인한 결과, MCD 다이어트를 유도한 군에서는 염증과 지방 입자의 수와 크기가 증가하였으나(그림4 a), 서열번호 1 펩타이드를 주입한 군에서는 염증 및 지방 입자의 수와 크기가 감소하였다. MCD 다이어트를 유도한 군에서 섬유화(그림4 b는 붉은색, c는 푸른색)가 크게 진행 되었고, 서열번호 1 펩타이드를 주입한 군에서는 섬유화가 크게 감소된 것을 확인할 수 있었다. NAS Score는 Ballooning degeneration, Lobular inflammation, Steatosis의 합계를 측정한 것이다. NAS Score에서도 펩타이드를 처리한 군에서 50% 이상 감소하였기 때문에 비알콜성 지방간이 개선된 것을 확인할 수 있었다(그림4 d).
[그림4] 비알콜성 지방간염 동물모델에서 펩타이드의 효과 확인
나이벡의 본 발명의 따른 펩타이드는 ATF3의 세포내 농도를 조절하여, 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환의 치료 용도로 활용할 수 있으며, 상기 펩타이드에 세포 내 투과능과 염증 억제 기능을 갖는 펩타이드를 추가로 융합시킴으로써 질환 치료 효과를 상승시켜 염증성 장 질환, 비알코올성지방간염 등 다양한 염증성 질환 치료제 개발에 유용할 것으로 판단된다.
특허법인 ECM
변리사 최자영
jychoi@ecmpatent.com
02-568-2675
출원번호
10-2019-0105916
출원일자
2019년08월28일
우선권주장(우선권주장일)
10-2018-0103614 (2018년08월31일)
출원인
주식회사 나이벡
공개번호(일자)
10-2020-0026121 (2020년03월10일)
발명의 명칭
염증 및 대사성 질환의 바이오마커에 대한 결합능이 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도
ATF3(Activating transcription factor 3) 단백질은 전사인자의 포유동물 활성전사조절인자/cAMP 반응요소-결합 단백질(mammalian activation transcription factor/cAMP responsive element-binding(CREB)protein)의 구성성분으로, ATF3 유전자는 암 발생에 관여하는 여러 요인들에 의해 나타나는 다양한 신호들에 의해 발현이 유도되며, 세포내 스트레스 반응의 복잡한 과정에 연관되어 있는 것으로 알려져 왔다.
대식세포, 비만세포, T 세포, 수지상 세포 등의 면역세포에서뿐만 아니라 섬유아세포나 상피세포를 비롯한 대부분의 세포에서 NF-κJNK, Erk, p38, PKC 등 다양한 경로가 ATF3를 유도하고, 유도된 ATF3는 다양한 유전자들의 전사를 조절하여 세포사멸, 세포성장, 세포이동, DNA 수선, 대사에 관여하며, 그 중에 NF-κ가 관계된 염증반응 유도에도 연관성이 있다고 알려져 있다.
현재 ATF3 단백질의 발현은 염증성 질환, 비만, 당뇨 등과의 연관성에 대한 많은 연구가 진행되고 있고 ATF3 단백질의 발현 또는 기능을 조절하는 물질에 의해, ATF3에 의해 유도되는 염증반응을 억제할 수 있을 것이나, 현재까지는 ATF3 단백질에 대한 효과적인 저해제가 개발되지는 않고 있다.
나이벡의 본 발명은 염증 및 대사성 질환의 바이오마커인 ATF3 단백질에 결합할 수 있는 신규한 펩타이드에 관한 것이다.
나이벡은 본 발명에서 ATF3에 결합하여 ATF3의 발현을 억제하고, ATF3에 의한 신호전달 경로를 저해하는 펩타이드와 이를 포함하는 약제학적 조성물을 개발하여 염증유발 사이토카인 (inflammatory cytokine)의 생성을 감소시키는 것을 확인하였다.
나이벡은 ATF3에 결합하는 특정한 펩타이드 서열을 발굴하기 위하여 파지 디스플레이 방법 (Phage display)을 이용하였다. 12 개 아미노산으로 구성된 랜덤 펩타이드 라이브러리가 표지된 파지들을 이용하여 발굴한 최종 17 개 클론의 서열 분석하였다.
그 결과, 2 개의 클론이 동일한 DNA 서열을 나타내는 4개의 서열을 확인하였고 이를 번역하여 12 개 아미노산으로 구성된 최종 펩타이드의 서열로 서열번호 1 (ABP1, AESPLTNRGWNP), 서열번호 2 (ABP2 (MLDTNIQSRPNL), 서열번호 3 (ABP3, TLGLRPVPVATT), 서열번호 4 (ABP3, VLNIPEHFTAQN)를 얻었다.
서열번호 1 내지 4의 펩타이드를 합성하고, ATF3 단백질과의 결합 친화성 (Binding affinity) 확인하였다. 분석결과, 농도 의존적으로 ATF3 단백질에 결합하는 경향을 확인하였다(그림1).
[그림1] ATF3 단백질과의 결합 친화성 확인
ATF3 단백질에 결합능이 있는 서열번호 1 내지 4의 펩타이드의 C말단에 서열번호 5의 펩타이드를 연결하여 서열번호 6 내지 9의 펩타이드를 합성하였다.
형광으로 표지된 서열번호1, 5, 6의 펜타이드를 RAW 264.7세포에 처리한 후 공초점 현미경으로 관찰한 결과, 서열번호 1의 펩타이드는 세포 내에서 약하게 붉은 색의 형광이 관찰된 되어 일부가 투과된 것을 확인하였다. 서열번호 5와 서열번호 6의 펩타이드는 서열 번호 1의 펩타이드보다 형광이 세포내에서 많이 관찰되어 세포 투과성이 높음을 확인할 수 있었다(그림2).
[그림2] 세포투과 정도를 관찰한 공초첨 현미경 사진
이는, 세포투과성이 낮은 서열번호 1의 펩타이드에 세포투과성이 높은 서열번호 5의 펩타이드를 결합시킴으로써(즉, 서열번호 6) ATF3 단백질에 결합력이 있는 펩타이드의 세포내 투과능을 더 증가시켜 세포 안에서 그 효과를 증가시킬 수 있음을 의미한다.
ATF3 결합 펩타이드에 의한 IL-6의 발현 감소 효과 확인하고자, HepG2 세포에 서열번호 1 내지 6의 펩타이드를 2시간 처리한 후, 팔미트산(palmitic acid)을 200μM 농도로 처리하여 24시간 동안 염증 반응을 유도하였다. 각각의 배지를 수거하여 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현정도를 ELISA 분석하였다.
분석결과, 팔미트산에 의해 증가된 IL-6의 발현량이 ATF3 결합 펩타이드에 의해 감소되었음을 확인할 수 있었다. 이는 ATF3 결합 펩타이드가 염증 유발 사이토카인의 생성을 감소시킴으로써 간질환 치료효과가 있다는 것을 증명하는 것이다. 또한, 서열번호 6은 IL-6의 발현량이 가장 감소한 것으로 보아, 서열번호 5의 세포투과능에 의해서 사이토카인의 발현억제 효과가 더욱 증가하였음을 알 수 있었다(그림3).
[그림3] ATF3 결합 펩타이드에 의한 IL-6의 발현 감소 효과 분석
또한 비알콜성 지방간염 동물모델에서 펩타이드의 효과를 확인한 결과, MCD 다이어트를 유도한 군에서는 염증과 지방 입자의 수와 크기가 증가하였으나(그림4 a), 서열번호 1 펩타이드를 주입한 군에서는 염증 및 지방 입자의 수와 크기가 감소하였다. MCD 다이어트를 유도한 군에서 섬유화(그림4 b는 붉은색, c는 푸른색)가 크게 진행 되었고, 서열번호 1 펩타이드를 주입한 군에서는 섬유화가 크게 감소된 것을 확인할 수 있었다. NAS Score는 Ballooning degeneration, Lobular inflammation, Steatosis의 합계를 측정한 것이다. NAS Score에서도 펩타이드를 처리한 군에서 50% 이상 감소하였기 때문에 비알콜성 지방간이 개선된 것을 확인할 수 있었다(그림4 d).
[그림4] 비알콜성 지방간염 동물모델에서 펩타이드의 효과 확인
나이벡의 본 발명의 따른 펩타이드는 ATF3의 세포내 농도를 조절하여, 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환의 치료 용도로 활용할 수 있으며, 상기 펩타이드에 세포 내 투과능과 염증 억제 기능을 갖는 펩타이드를 추가로 융합시킴으로써 질환 치료 효과를 상승시켜 염증성 장 질환, 비알코올성지방간염 등 다양한 염증성 질환 치료제 개발에 유용할 것으로 판단된다.
특허법인 ECM
변리사 최자영
jychoi@ecmpatent.com
02-568-2675