출원번호 | 10-2019-0155588 |
출원일자 | 2019년11월28일 |
특허권자 | 주식회사 엘앤씨바이오 |
등록번호(일자) | 10-2302770 (2021년09월09일) |
발명의 명칭 | 인체 유래 성분을 함유하고 조직 특이적 세포 분화 효과를 갖는 3D 프린팅 바이오 잉크 조성물 및 그 제조방법 |
조직 공학은 생물학, 공학, 재료공학을 기반으로 인체 조직 또는 기관을 만들어 손실 또는 손상된 조직을 대체하는 것이다. 산업화, 고령화로 인하여 인체 조직이 손실 또는 손상되는 환자 수가 증가하고 있으며, 이로 인해 손실 또는 손상된 조직을 보충하기 위한 조직공학 분야의 범위가 확대되고 있다.
최근에는 3D 바이오 프린팅이 주목 받고 있다. 3D 바이오 프린팅은 목표 구조물을 삼차원으로 스캐닝하여 이미지를 얻어, 세포와 바이오 잉크를 통해 스캐닝한 이미지를 삼차원 구조 형태로 만드는 것이다. 바이오 프린팅은 살아있는 세포를 포함하는 것이 핵심이므로, 세포와 함께 섞여서 삼차원 구조를 이루는 물질인 바이오 잉크는 3D 바이오 프린팅에서 가장 중요한 부분이다.
바이오 잉크는 미세 3D 구조를 유지할 수 있는 물리화학적 특성과 살아있는 세포와 함께 사용할 수 있는 수준의 생물학적 안전에 관한 특성을 모두 가지고 있어야 한다. 바이오 잉크를 구성하는 물질 요소들은 체내 이식후, 신생조직이 출력물을 통해 이식부위에서 재생되는 동안, 신생 조직의 재생 경향과 부합되는 수준으로 출력물의 체내 분해 경향을 보여야 한다.
엘앤씨바이오의 본 특허는 인체 조직 유래 성분을 함유하는 3D 바이오 프린팅용 잉크에 관한 것으로, 상기 잉크는 미세입자화된 인체 조직 유래 성분 및 생체적합성 고분자를 포함하며, 상기 인체 조직 유래 성분은 입경 10 내지 1000 um인 것을 특징으로 한다.
본 특허에 따른 바이오 잉크 조성물을 3D 바이오 프린팅에 적용하여 출력되는 출력물 내 세포는 바이오 잉크의 인체 조직 기원을 따라 분화할 수 있다. 바이오 잉크 조성물이 살아있는 세포를 포함하는 경우, 3D 바이오 프린팅으로 출력된 출력물은 미세입자화된 인체 조직 성분을 함유하기 때문에 세포친화력이 높고 세포가 장기간 생존할 수 있으며, 또한 인체 조직이 세포 성장인자 및 분화 인자를 함유하고 있어 세포의 기능과 분화를 조절할 수 있다.
.본 특허의 실시예에서 미세입자화된 무세포 동종 진피(Micronized Acellular Dermal Matrix, M-ADM) 조직을 포함하는 바이오 잉크(실시예1) 및 미세입자화된 무세포 동종 연골(Micronized Acellular Cartilage, M-AC) 조직을 포함하는 바이오 잉크(실시예2)를 제조하였다.
각 바이오 잉크의 세포 친화능을 확인하고자, 바이오 잉크내에서 지방 유래 줄기세포의 생존능을 분석하였다.
그림1A)과 (B)를 참조하면, M-ADM 또는 M-AC 기반 바이오 잉크 모두 배양 시간이 지남에 따라 세포의 양이 바이오 잉크 구조체 내에서 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 바이오 잉크 조성물 중의 M-ADM 또는 M-AC과 알긴산의 비율을 적절히 조절함으로써, 지방유래 줄기세포를 생존 및 증식하게 하는 세포적합성 및 세포친화성을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
[그림1] M-ADM 바이오 잉크(A), M-AC 바이오 잉크(B)에서 지방 유래 줄기세포의 생존능 분석결과
바이오 잉크의 활성을 확인하고자, M-ADM 기반 바이오 잉크에서의 지방유래 줄기세포의 섬유아세포로의 분화와 M-AC 기반 바이오 잉크 내에서의 지방유래 줄기세포가 연골세포로의 분화 여부를 확인하였다.
그림2(A)를 통해 지방유래 줄기세포가 M-ADM 기반 바이오 잉크의 지지체 내에서 섬유아세포의 마커인
collagen type 1과 alpha-SMA를 발현하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 그림2(B)를 통해, 지방유래 줄기세포가 M-ADM 기반 바이오 잉크와 함께 5주까지 배양되었을 때, FSP-1의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이 때의 발현양은 섬유아세포가 발현하는 FSP-1의 양과 비슷하거나 우위의 수준임을 확인할 수 있다.
그림2(C)는 사람 연골세포와 지방유래 줄기세포를 염색한 것으로 각각의 표지자인 Aggrecan과 CD44의 발현을 나타낸다. 또한, 그림2(D)는 M-AC 기반 바이오 잉크 지지체 내에서의 지방유래 줄기세포를 염색하여 각각의 특정 표지자의 발현을 확인하였다. 이를 통해, M-AC 기반 바이오 잉크 지지체 내에서 배양 초기에는 지방유래줄기세포의 표지자인 CD44가 발현되었지만, 배양 후 연골세포의 표지자인 Aggrecan가 발현되는 것을 확인할 수 있다.
또한, 그림2(E)를 통해, 지방유래 줄기세포가 M-AC 기반 바이오 잉크와 함께 2주까지 배양되었을 때, Collagen type II와 SOX-9의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이 때의 발현양은 인간 연골세포가 발현하는 Collagen type II와 SOX-9의 양과 비슷하거나 우위의 수준임을 확인할 수 있다.
[그림2] M-ADM 바이오 잉크(A), M-AC 바이오 잉크(B)에서 지방 유래 줄기세포의 분화능 평가
M-ADM 기반 바이오 잉크가 3D 프린터로 출력이 가능한지 확인하기 위해 3D 바이오 프린터를 이용하여 출력을 수행하였다. 도 1은 M-ADM 기반 바이오 잉크(A)와 M-AC 기반 바이오 잉크(B)를 이용하여 프린팅을 수행한 결과물이다. 두 잉크 모두 계획했던 모양에 맞게 무너지지 않은 형태와 강도의 구조체를 제조할 수 있었다.
[그림3] M-ADM 바이오 잉크(A), M-AC 바이오 잉크(B)의 바이오 프린팅 구조체의 형태의 강도 확인
엘엔씨바이오는 미세입자화된 인체 조직이 포함된 바이오 잉크가 3D 프린터를 통해 다양한 구조와 모양으로 프린팅 될 수 있으며, 바이오 프린팅을 위한 바이오 잉크로서 사용 가능함과 바이오 잉크가 제공하는 환경의 영향으로 줄기세포가 바이오 잉크 내 인체 조직 특이성에 따라 분화되는 것을 검정하였다.
엘엔씨바이오는 본 특허의 등록으로 연골ㆍ피부ㆍ뼈 등 결손된 인체 부위를 환자 맞춤형으로 대체시킬 수 있는 인체조직 제작기술을 확보하였다. 3D 프린팅 바이오잉크 기술은 연조직(피부ㆍ연골) 뿐만 아니라 경조직(뼈) 재생분야 등 적용가능범위가 매우 넓다.
현재 엘앤씨바이오는 소이증 환자치료를 위한 동물실험 연구 등에 집중하고 있으며, 무릎 반월상 및 생체 이식용 뻐 등 시장이 크고 수요가 많은 분야로 기술을 확장해 나갈 예정이다. 생체 안정성이 우수한 환자 맞춤형 인체조직 제조 기술이 관절염, 및 기타 다양한 질환에서 본 기술이 새로운 치료 방안을 제시해 줄 것으로 예상된다.
특허법인 ECM
변리사 최자영
jychoi@ecmpatent.com
02-568-2675
참조
엘앤씨바이오, 국내최초 인체조직유래 3D프린팅용 바이오잉크 기술특허 취득, 팜이데일리, 2021년 10월 1일
출원번호
10-2019-0155588
출원일자
2019년11월28일
특허권자
주식회사 엘앤씨바이오
등록번호(일자)
10-2302770 (2021년09월09일)
발명의 명칭
인체 유래 성분을 함유하고 조직 특이적 세포 분화 효과를 갖는 3D 프린팅 바이오 잉크 조성물 및 그 제조방법
조직 공학은 생물학, 공학, 재료공학을 기반으로 인체 조직 또는 기관을 만들어 손실 또는 손상된 조직을 대체하는 것이다. 산업화, 고령화로 인하여 인체 조직이 손실 또는 손상되는 환자 수가 증가하고 있으며, 이로 인해 손실 또는 손상된 조직을 보충하기 위한 조직공학 분야의 범위가 확대되고 있다.
최근에는 3D 바이오 프린팅이 주목 받고 있다. 3D 바이오 프린팅은 목표 구조물을 삼차원으로 스캐닝하여 이미지를 얻어, 세포와 바이오 잉크를 통해 스캐닝한 이미지를 삼차원 구조 형태로 만드는 것이다. 바이오 프린팅은 살아있는 세포를 포함하는 것이 핵심이므로, 세포와 함께 섞여서 삼차원 구조를 이루는 물질인 바이오 잉크는 3D 바이오 프린팅에서 가장 중요한 부분이다.
바이오 잉크는 미세 3D 구조를 유지할 수 있는 물리화학적 특성과 살아있는 세포와 함께 사용할 수 있는 수준의 생물학적 안전에 관한 특성을 모두 가지고 있어야 한다. 바이오 잉크를 구성하는 물질 요소들은 체내 이식후, 신생조직이 출력물을 통해 이식부위에서 재생되는 동안, 신생 조직의 재생 경향과 부합되는 수준으로 출력물의 체내 분해 경향을 보여야 한다.
엘앤씨바이오의 본 특허는 인체 조직 유래 성분을 함유하는 3D 바이오 프린팅용 잉크에 관한 것으로, 상기 잉크는 미세입자화된 인체 조직 유래 성분 및 생체적합성 고분자를 포함하며, 상기 인체 조직 유래 성분은 입경 10 내지 1000 um인 것을 특징으로 한다.
본 특허에 따른 바이오 잉크 조성물을 3D 바이오 프린팅에 적용하여 출력되는 출력물 내 세포는 바이오 잉크의 인체 조직 기원을 따라 분화할 수 있다. 바이오 잉크 조성물이 살아있는 세포를 포함하는 경우, 3D 바이오 프린팅으로 출력된 출력물은 미세입자화된 인체 조직 성분을 함유하기 때문에 세포친화력이 높고 세포가 장기간 생존할 수 있으며, 또한 인체 조직이 세포 성장인자 및 분화 인자를 함유하고 있어 세포의 기능과 분화를 조절할 수 있다.
.본 특허의 실시예에서 미세입자화된 무세포 동종 진피(Micronized Acellular Dermal Matrix, M-ADM) 조직을 포함하는 바이오 잉크(실시예1) 및 미세입자화된 무세포 동종 연골(Micronized Acellular Cartilage, M-AC) 조직을 포함하는 바이오 잉크(실시예2)를 제조하였다.
각 바이오 잉크의 세포 친화능을 확인하고자, 바이오 잉크내에서 지방 유래 줄기세포의 생존능을 분석하였다.
그림1A)과 (B)를 참조하면, M-ADM 또는 M-AC 기반 바이오 잉크 모두 배양 시간이 지남에 따라 세포의 양이 바이오 잉크 구조체 내에서 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 바이오 잉크 조성물 중의 M-ADM 또는 M-AC과 알긴산의 비율을 적절히 조절함으로써, 지방유래 줄기세포를 생존 및 증식하게 하는 세포적합성 및 세포친화성을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
[그림1] M-ADM 바이오 잉크(A), M-AC 바이오 잉크(B)에서 지방 유래 줄기세포의 생존능 분석결과
바이오 잉크의 활성을 확인하고자, M-ADM 기반 바이오 잉크에서의 지방유래 줄기세포의 섬유아세포로의 분화와 M-AC 기반 바이오 잉크 내에서의 지방유래 줄기세포가 연골세포로의 분화 여부를 확인하였다.
그림2(A)를 통해 지방유래 줄기세포가 M-ADM 기반 바이오 잉크의 지지체 내에서 섬유아세포의 마커인
collagen type 1과 alpha-SMA를 발현하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 그림2(B)를 통해, 지방유래 줄기세포가 M-ADM 기반 바이오 잉크와 함께 5주까지 배양되었을 때, FSP-1의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이 때의 발현양은 섬유아세포가 발현하는 FSP-1의 양과 비슷하거나 우위의 수준임을 확인할 수 있다.
그림2(C)는 사람 연골세포와 지방유래 줄기세포를 염색한 것으로 각각의 표지자인 Aggrecan과 CD44의 발현을 나타낸다. 또한, 그림2(D)는 M-AC 기반 바이오 잉크 지지체 내에서의 지방유래 줄기세포를 염색하여 각각의 특정 표지자의 발현을 확인하였다. 이를 통해, M-AC 기반 바이오 잉크 지지체 내에서 배양 초기에는 지방유래줄기세포의 표지자인 CD44가 발현되었지만, 배양 후 연골세포의 표지자인 Aggrecan가 발현되는 것을 확인할 수 있다.
또한, 그림2(E)를 통해, 지방유래 줄기세포가 M-AC 기반 바이오 잉크와 함께 2주까지 배양되었을 때, Collagen type II와 SOX-9의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이 때의 발현양은 인간 연골세포가 발현하는 Collagen type II와 SOX-9의 양과 비슷하거나 우위의 수준임을 확인할 수 있다.
[그림2] M-ADM 바이오 잉크(A), M-AC 바이오 잉크(B)에서 지방 유래 줄기세포의 분화능 평가
M-ADM 기반 바이오 잉크가 3D 프린터로 출력이 가능한지 확인하기 위해 3D 바이오 프린터를 이용하여 출력을 수행하였다. 도 1은 M-ADM 기반 바이오 잉크(A)와 M-AC 기반 바이오 잉크(B)를 이용하여 프린팅을 수행한 결과물이다. 두 잉크 모두 계획했던 모양에 맞게 무너지지 않은 형태와 강도의 구조체를 제조할 수 있었다.
[그림3] M-ADM 바이오 잉크(A), M-AC 바이오 잉크(B)의 바이오 프린팅 구조체의 형태의 강도 확인
엘엔씨바이오는 미세입자화된 인체 조직이 포함된 바이오 잉크가 3D 프린터를 통해 다양한 구조와 모양으로 프린팅 될 수 있으며, 바이오 프린팅을 위한 바이오 잉크로서 사용 가능함과 바이오 잉크가 제공하는 환경의 영향으로 줄기세포가 바이오 잉크 내 인체 조직 특이성에 따라 분화되는 것을 검정하였다.
엘엔씨바이오는 본 특허의 등록으로 연골ㆍ피부ㆍ뼈 등 결손된 인체 부위를 환자 맞춤형으로 대체시킬 수 있는 인체조직 제작기술을 확보하였다. 3D 프린팅 바이오잉크 기술은 연조직(피부ㆍ연골) 뿐만 아니라 경조직(뼈) 재생분야 등 적용가능범위가 매우 넓다.
현재 엘앤씨바이오는 소이증 환자치료를 위한 동물실험 연구 등에 집중하고 있으며, 무릎 반월상 및 생체 이식용 뻐 등 시장이 크고 수요가 많은 분야로 기술을 확장해 나갈 예정이다. 생체 안정성이 우수한 환자 맞춤형 인체조직 제조 기술이 관절염, 및 기타 다양한 질환에서 본 기술이 새로운 치료 방안을 제시해 줄 것으로 예상된다.
특허법인 ECM
변리사 최자영
jychoi@ecmpatent.com
02-568-2675
참조
엘앤씨바이오, 국내최초 인체조직유래 3D프린팅용 바이오잉크 기술특허 취득, 팜이데일리, 2021년 10월 1일