식물체를 이용한 유용 생리활성 물질의 생산은, 동물세포나 미생물에서 합성하여 단백질을 생산하는 방법에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원을 원천 배제할 수 있으며, 해당 유용물질의 수요가 급증할 때 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물세포 시스템과 비교하면 절대적으로 유리하기 때문에, 최단기간에 저비용으로 대량생산이 가능하다는 장점으로 인해 최근 백신 개발 및 치료제 개발 등 의료산업 분야에 널리 사용되고 있다.

식물을 이용하여 외래 단백질 생산 시스템은 식물세포의 번역 후 변형은 동물세포에서 이루어지는 것과 매우 유사하여 정확하게 복합 단백질(Multimeric protein)을 생성할 수 있다. 식물 시스템을 이용하여 생산한 당단백질의 경우, 당화(Glycosylation)되는 아미노산 잔기는 원래의 단백질에서와 동일하게 일어난다.

따라서 식물 발현 시스템을 이용한 단백질 생산이 동물세포나 미생물을 이용하여 생산하는 방법을 대체할 수 있는 잠재적인 가능성이 있어 최근에 큰 주목을 받고 있다.지금까지의 연구 결과로 식물체에서 유래된 재조합 항원 단백질은 동물 유래 백신과 동일한 기능을 갖는 구조로 되어 있음이 보고되고 있어, 이를 응용한 다양한 연구가 요구되고 있다.

바이오앱과 한미사이언스의 본 특허는 COVID-19 백신용 단백질, 이를 식물에서 발현하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

구체적으로 본 특허에 따른 COVID-19 백신용 단백질은 S1-Fd 재조합 항원 단백질로 NB(New Bip; new chaperone binding protein) 단백질; 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)의 S1 서브유닛 단백질; T4 피브리틴(fibritin)의 Fd(foldon) 폴리펩타이드; 및 HDEL 펩타이드가 융합된 단백질이다.

본 특허의 실시예에서 식물체에서 재조합 스파이크 당단백질을 발현시킬 수 있도록, 그림 1과 같은 식물체 발현용 재조합 벡터를 제작하였다.

[그림1] 조합 스파이크 당단백질 발현 벡터

구체적으로, 니코티아나 벤타미아나에서의 발현에 최적화된 서열로 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛 유전자를 합성하였다. 소포체로 표적화되는 재조합 스파이크 당단백질 식물 발현벡터는 pCAMBIA1300 벡터를 기본 벡터로 사용하였으며, CaMV35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자 사이에 NB 시그널 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 스파이크 당단백질의 S1 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, T4 피브리틴의 27개 아미노산인 foldon(Fd)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 연결하여 S1-Fd 재조합 스파이크 당단백질(spike glycoprotein) 발현용 식물 발현 벡터인 pTEX-NB:S1:L:Foldon:8H 벡터를 제조하였다.

또한 식물체에서 재조합 RBD 단백질을 발현시킬 수 있도록 그림2과 같이 벡터를 제조하였다.

[그림2] 재조합 RBD 단백질 발현 벡터

구체적으로, 니코티아나 벤타미아나에서의 발현에 최적화된 RBD(D(receptor binding domain) 유전자를 합성하였으며, RBD 식물 발현 벡터는 pCAMBIA1300 벡터를 기본 벡터로 사용하였으며, CaMV35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자사이에 NB 시그널 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, RBD 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 면역글로불린 hFc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 연결하여 RBD-Fc 재조합 단백질 발현용 식물 발현 벡터인 pTEX-NB:RBD:hFc 벡터를 제조하였다.

[그림3] 당화된 스파이크 당단백질의 전체 구조 및 RBD 도메인의 위치

COVID-19 항원 단백질인 스파이크 당단백질과 상기 단백질의 리셉터 결합 도메인으로 알려진 RBD에 대한 3차 구조를 분석하였다. 그림3의 A에서 SS는 신호서열을, NTD는 N-터미날 도메인을, RBD는 리셉터 결합 도메인을, SD1은 subdomain 1을, SD2는 subdomain 2를, S1/S2는 프로테아제절단 사이트를, S2', S2'는 프로테아제 절단 사이트를, FP은 퓨전 펩타이드를, HR1은 heptad repeat 1을, CH는 central helix를, CD는 연결 도메인을, HR2는 heptad repeat 2를, TM은 트렌스 멤브레인 도메인을, CT는 세포 내 꼬리를 각각 나타낸 것이다. 또한, 그림3의 B는 스파이크 당단백질의 전체 구조에 대한 모식도를 나타낸 것으로, N-terminal은 NTD와 RBD로 구성되어 있으며, CTD와 긴 loop을 통해 연결되어 있다. 또한, 스파이크 당단백질이 단량체로 존재 시 RBD가 다운 되어 있다가 삼량체를 형성하게 되면 1개의 RBD가 위로 돌출된 구조를 형성하는 것으로 확인되었다.

다음으로 식물체 내에서 발현 및 정제한 S1-Fd 재조합 단백질 및 RBD-Fc 재조합 단백질의 COVID-19 백신으로의 사용 가능성을 분석하였다.

바이러스 또는 세균에 의한 감염에 대한 방어 기작 중 하나는 T세포의 활성화를 통해 이루어진다. 이에 본 특허에 따른 식물에서 생산된 S1-Fd 재조합 항원 단백질을 다른 농도의 GLA-SE 어쥬번트(1μg, 3 μg, 5 μg)와 함께 섞어 2번 면역시킨 마우스의 비장세포를 이용하여 항원단백질로 자극 한 후, IFN-γ 와TNF-α를 각각 생산하는 CD8⁺ T세포와 CD4⁺ T세포를 유세포 분석기로 측정 후 분석하였다.

[그림4] 비장세포에서 항원 단백질 자극 후 CD4⁺T 세포의 유세포 분석 결과

비장세포에 본 발명의 항원 단백질로 자극한 후, CD4⁺ IFN-γ⁺ T세포를 확인한 결과, PBS 처리군에 비해 본 발명의 재조합 항원 단백질과 GLA-SE 아주번트를 투여한 군에서 CD4⁺ IFN-γ⁺ T세포의 수가 증가된 것으로 나타났다. 특히 GLA-SE 1, 3, 5 μg 실험군 모두에서 항원 단백질 10 μg으로 자극하였을 때, 더 뚜렷하게 유의적으로 CD4+ IFN-γ+ T 세포가 증가하는 것을 확인하였다(그림4).

[그림5] 비장세포에서 항원 단백질 자극 후 CD8⁺T 세포의 유세포 분석 결과

또한, 비장세포에 본 발명의 재조합 항원 단백질로 자극한 후, CD8⁺ IFN-γ⁺ T 세포를 확인한 결과, PBS 처리군에 비해 본 발명의 항원 단백질과 GLA-SE 어주번트를 투여한 군에서 모두 유의성 있게 CD8⁺ IFN-γ⁺ T세포수가 증가한 것으로 나타났다. 또한, 재조합 항원 단백질 10 μg으로 자극하였을 때, GLA-SE 1μg 실험군의 경우 더욱 CD8⁺IFN-γ⁺ T세포수가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(그림5).

식물체로부터 발현 및 정제된 S1-Fd 재조합 항원(COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질)이 항원 특이적으로 T세포의 활성화를 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있었고, 따라서 COVID-19의 예방 및 치료를 위한 백신 용도로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서 바이오앱 및 한미사이언스의 본 특허에 따른 COVID-19 백신용 재조합 항원 단백질은 식물체로부터 생산된 그린백신으로, 동물세포 사용에 따른 고가의 비용을 절감할 수 있고, 동물세포에서의 번역 후 변형 형태와 동일한 고유 단백질의 형태로 수득할 수 있어 우수한 백신 효과를 유도할 수 있다.

그린백신은 식물에서 분리 정제한 재조합 단백질을 활용해 기존 백신 대비 부작용이 거의 없고 효과는 우수하다는 게 장점으로 꼽힌다. 대한민국 정부도 2020년 9월 각종 지원을 통해 식물백신, 유전자가위, 생명소재, 동물용 의약품 등 그린바이오 산업을 2030년까지 12조원 규모로 키운다는 계획은 발표하였다.

이에 차세대 그린바이오 사업인 식물체 기반의 그린백신이 빠른 시일내에 개발이 완료되어 상용화될 것으로 기대된다.

특허법인 ECM

변리사 최자영

jychoi@ecmpatent.com

02-568-2675

참조

한미사이언스와 손잡은 바이오앱, 하반기 특례상장 추진, 이데일리, 2021년 03-월 09일