혈뇌장벽(blood-brain barrier, BBB)은 뇌혈관의 내피세포 간의 조밀한 연결(tight junction) 및 이를 더욱 강화하는 성상세포(astrocyte)로 이루어진 구조물로서, 혈관 내부의 물질이 혈관벽을 통과하여 뇌 실질 내로 쉽게 나오지 않게 해주는 기능을 한다. 이런 이유로 뇌질환 치료제로 개발된 상당수의 약이 뇌혈관 장벽의 통과가 잘 이루어지지 않는 문제점을 갖고 있다. 이러한 혈뇌장벽의 투과 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았으며, 중추 신경계에 장애가 발생해도 약물을 중추 신경계의 목적으로 하는 영역에 도달시킬 수 없는 현실이며, 효과적인 치료방법들은 아직 개발되지 않았다.

최근, 약물의 보다 안전하고 효과적인 이용을 도모하기 위해, 약물에 적합한 제형뿐만 아니라 약물의 표적이 되는 생체 부위에 효율적으로 약물을 전달(drug delivery)하는 방법이 주목받고 있다. 특히, 약물을 필요한 때에, 필요한 양만큼, 필요한 장소로 효율적으로 운반하는 수송 시스템인 약물 전달 시스템(DDS; Drug Delivery System)의 실용화가 요구되고 있다.

현재 혈뇌장벽을 통과하여 약물 등을 전달해 줄 수 있는 전달체(carrier)에 대한 개발 역시 활발하게 진행 중이지만, 혈뇌장벽을 투과할 수 있는 DDS는 개발되지 않은 상황이다.

시선테라퓨틱스는 본 특허는 혈뇌장벽 (Blood-Brain Barrier) 투과능을 가지는 새로운 구조의 핵산 복합체에 관한 것으로, 본 특허에서 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 우수한 효율로 혈뇌장벽을 통과할 수 있음을 확인하였다.

[구조식 (1)]

[ A ≡ C⁽⁺⁾]

상기 구조식 (1)에 있어서, A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열, 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고, C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고, '≡'는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며, A로 표시되는 생활성 핵산은 펩티드 핵산으로, 전체적으로 음전하를 가지며, C⁽⁺⁾로 표시되는 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지고,A ≡ C⁽⁺⁾ 로 표시되는 구조식 (1)의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가진다.

상기, 캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함하며, 상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체가 음전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적인 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에서 표 1과 같이 혈뇌장벽 통과능 확인을 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산를 제조하고, 마우스에서 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 복합체를 투여하고, 혈광장벽 투과능을 분석하였다.

[표 1] 혈뇌장벽 통과능 확인을 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열

그림1은 투여 후 1일(DAY1) 및 3일차(DAY3)의 뇌 조직 공초점 현미경 분석 영상이다. a는 1일차의 뇌 조직 앞쪽 영역인 전두엽 (prefrontal cortex), 측뇌실 (lateralventricle), 시교차상핵 (paraventricular nucleus)에서 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 것이다. b는 핵산복합체 투여 후 1일차의 뇌 조직 뒤쪽 영역인 해마 (hippocampus), 중간뇌 (midbrain), 소뇌(cerebellum)에서 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 것이다. c는 핵산복합체 투여 후 3일차의 뇌 조직 앞쪽 영역인 전두엽, 측뇌실, 시교차상핵 에서 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 것이다. d는 핵산복합체 투여 후 3일차의 뇌 조직 뒤쪽 영역인 해마, 중간뇌, 소뇌에서 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 것이다.

[그림1] 투여 후 1일(DAY1) 및 3일차(DAY3)의 뇌 조직 공초점 현미경 분석

분석결과, 핵산 복합체를 투여한 실험군에서 cy3에 의한 형광 발현이 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 기존에 혈뇌장벽을 통과한다고 알려진 메토트렉세이트를 단독 투여군에 비해서 형광 발현이 높게 나타나는 것을 확인하였다. 따라서 핵산 복합체에 의해 메토트렉세이트의 혈뇌장벽 투과도 및 생체 이용률이 증가한다는 것을 확인하였다.

DAY1과 DAY3의 그룹을 분리하여 수치를 분석하였을 때, DAY1에서는 핵산 복합체의 형광값이 뇌 조직의 앞쪽 영역 인 전두엽, 시교차상핵 보다 뒤쪽 영역 인 중간뇌, 소뇌 부위에서 높게 나타나는 것이 확인되었고, DAY3에서는 뇌조직의 앞쪽 영역인 전두엽까지 형광이 확산하여 형광 발현이 높게 나타나는 것을 확인하였다. 따라서, 혈관과 뇌 조직 영역의 순환계에 따라 핵산 복합체가 투과되어 확산하는 것을 확인하였다(그림1).

핵산 복합체의 혈뇌장벽 투과능에 대한 효과를 검정하기 위하여, 엔도좀 탈출 (endosome escape)을 도와주는 물질을 포함하는 혈관내피세포 성장인자(VEGF) 안티센스핵산에 클로람부실 (chlorambucil)과 형광물질(cy3)을 표지한 생활성 핵산 및 엔도좀 탈출을 도와주는 물질을 포함하는 캐리어 핵산과의 복합체를 만들어 사용하였다. 클로람부실 은 기존에 혈뇌장벽을 통과하지 않는 물질로 알려진 약물이다.

동물모델에서 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 포함된 핵산 복합체 조합 투여에 따른 혈뇌방볍 투여능을 분석한 결과, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 포함된 핵산 복합체를 투여한 실험군에서 cy3에 의한 형광 발현이 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 기존에 혈뇌장벽을 통과하지 못하는 약물을 표지하였음에도 불구하고 핵산 복합체에 의해 투과가 되었음을 확인하였다.

그 다음, 핵산 복합체를 투여한 모든 실험군에 대해 투여한 일자에 따른 조직 내 형광 분포를 수치화하여 핵산복합체를 투여한 후 뇌의 각 조직에서의 형광 발현 분포를 비교하였다. 그 결과, DAY1에서는 핵산 복합체의 형광 발현 분포가 여러 뇌 영역 중 뇌의 뒷부분인 중간뇌, 소뇌 부위에서 높게 나타나는 것을 확인하였으며, 이를 수치화하였을 때 대조군에 비해 핵산 복합체를 투여한 군에서 뇌 앞쪽 영역은 2배 혹은 3배, 뒤쪽 영역은 크게 10배까지 형광값이 증가한 것을 확인할 수 있었다 (그림2a). DAY3의 경우 뇌 영역 중 뇌의 앞부분인 전두엽까지 형광 발현 분포가 높게 나타나는 것을 확인하였고, 이를 수치화하여 비교하였을 때 핵산 복합체를 투여한 그룹에서 대조군에 비해 뇌의 앞쪽 영역에서 10배 이상, 뒤쪽 영역은 2.5배 형광값이 증가한 것을 확인하였다 (그림2b).

[그림2] 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 포함된 핵산복합체 투여 후 뇌의 각 조직에서의 형광 발현 분석

본 특허에 따른 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체는 혈뇌장벽을 우수한 효율로 통과할 수 있다. 특히, 핵산 복합체에 약물을 결합시킬 경우 약물을 혈뇌장벽 투과능이 증가하므로, 중추 신경계 질환의 치료 또는 진단에 다양할게 활용 가능할 것으로 기대된다.

특허법인 ECM

변리사 최자영

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