출원번호 | 10-2020-0031801 |
출원일자 | 2020년03월16일 |
출원인 | (주) 테라베스트 |
공개번호(일자) | 10-2020-0110253 (2020년09월23일) |
발명의 명칭 | 세포 조성물, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 아토피 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
아토피 피부염(atopic dermatitis)은 심한 소양증과 특징적인 피부 소견을 보이는 만성 염증성 질환이다. 유전적 배경, 면역학적 기전, 환경적 요인 등 다양한 인자로 이해 발병되는 것으로 알려져 있다. 가장 유력한 발병 기전에 대한 가설 중 하나는 Th1/Th2 세포의 항상성이 깨지면서 Th2 세포가 과활성되는 것이다. 특정 알레르겐 (allergen)에 의해 과활성화된 Th2 세포는 IL-4 및 IL-31 과 같은 Th2 사이토카인을 분비하고, 분비된 사이토카인은 B 세포의 IgE 분비와 비만세포 (Mast cell)의 탈과립을 유도하여 여러 염증 물질을 방출시킨다.
아토피 피부염에 현재까지는 항염증제인 코르티코스테로이드와 같은 물질을 사용하여 면역세포의 전반적인 활성을 억제시키는 방법을 사용하고 있을 뿐이며, 위 방법은 지속기간이 매우 짧을 뿐만 아니라 심한 부작용을 내포하고 있다. 또한, 최근 개발된 저분자 및 항체 치료제의 경우 한가지의 염증물질에 결합하는 수용체를 차단하는 수준이기 때문에 아토피와 같이 복잡한 염증 신호체계를 매개로 한 만성 피부염을 치료하기에는 한계가 있으며, 다른 경로를 통한 아토피 재발위험을 피하기 쉽지 않다.
최근에는 Th1 사이토카인의 일종인 IFN-γ 단백질을 이용하여 Th2 세포의 활성을 억제함으로써 아토피 피부염을 개선시키려는 시도들이 있었으나, IFN-γ 단백질은 체내 반감기가 극히 짧아 치료효과에 한계가 있다.
테라베스트의 본 특허는 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상인 세포 조성물에 관한 것으로, 아토피의 병인에 부합하여 Th1/Th2 면역체계 균형화를 통한 근본적인 치료 접근을 통해 치료효과를 극대화 시킬 수 있을 것으로 기대된다.
본 특허에 따른 세포 조성물은 인간의 말초혈액으로부터 단핵구 및 자가혈장을 각각 분리하여 수득하는 단계; 항-CD3 항체로 세포 배양용기를 코팅하는 단계; 및 상기 단핵구를 상기 세포 배양용기에 접종하여 IL-2, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조될 수 있다. 또한 제조된 총 세포 중 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60%이상인 것으로 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에서 체외증강 면역세포(Ex-vivo Boosted Imuune cell, EBI)를 배양하고, 이들 세포의 표현형을 분석한 결과, 인터페론-감마 및 NKG2D를 발현하는 세포의 비율이 매우 높으며, IL-4 및IL-13을 발현하는 세포의 비율이 낮아 아토피 피부염 예방 및 치료에 적합함을 확인하였다.
또한 OVA로 유도된 아토피피부염 개선에 대한 EBI의 효과를 분석한 결과, EBI를 투여한 군에서 피부병변 형태, 피부두께 등 아토피피부염의 임상적 특징이 개선되는 우수한 효과를 보였다.
정상마우스에 비하여 OVA로 유발된 대조군의 경우 피부장벽 붕괴 및 염증을 동반한 피부학적 증상 (건조, 홍반, 짓무름, 부종/혈종, 태선)과 표피두께가 심화된데 비해서 EBI를 투여한 실험군에서 증상들이 개선되는 효과를 보였다 (그림1A 내지 D). 이러한 평가 후 피부조직학적 개선효과를 알아보기 위하여 H&E로 피부조직을 염색하여 현미경으로 검경한 결과 OVA로 유발된 대조군은 정상군에 피해서 표피 두께와 피부장벽붕괴가 매우 증가되었다.
표피(epidermis)와 진피(dermis)가 부종으로 현저하게 확장되었고, epidermis의 탈락과 두께의 두꺼워짐을 확인할 수 있었다. 그러나 EBI를 투여한 군에서는 대조군에 비해서 피부조직학적 특징이 개선되는 효과를 보였다. 과각화증(hyperkeratosis), 이상각화증(parakeratosis)은 전반적으로 감소하였고, 표피(epidermis)의 두께도 줄어듬으로써 표피과다형성 (hyperplasia) 및 표피해면화 (spongiosis)도 줄어들었다. 또한 염증성 반응으로 두꺼워진 진피(dermis)의 두께도 얇아졌고, 퇴화되었던 모낭도 새로 형성되고 있음을 알 수 있다 (그림1 A,B).
또한 EBI를 투여한 군에서 대조군에 비해 아토피피부염의 심각성 정도(AD severity score)가 개선되었으며 (그림1 C), 긁는 행동이 상대적으로 감소하면서 소양감이 현저히 감소하였다 (그림1 D). 몸무게 변화를 측정하여 동물에 미치는 영향을 관찰한 결과, EBI 투여는 마우스의 체중에 영향을 주지 않았다 (그림1 E).
[그림1] OVA으로 유도된 아토피 모델에서 EBI의 개선효과
EBI의 알레르기 피부반응 및 IgE 억제 효과가 Th2 면역반응과 관련이 있는 지 확인하기 위해 OVA에 감작된 마우스로부터 피부조직을 분리하여 Th2 사이토카인의 mRNA 발현수준을 확인하였다. 실험결과, NOR군에 비해 OVA 처리군에서 Th2 분화유도 사이토카인 TSLP, IL-25, IL-33과 Th2 및 Th17 관련 사이토카인의 발현이 현저하게 증가하였다. 반면에 CsA 및 EBI 투여 마우스에서는 IL-4가 46.8%, IL-13이 47.3%, TSLP가 53.1%, IL-33이 49.2%가 감소하는 등 유의적으로 억제되었다. 양성대조군인 CsA처리군도 각각 33.6, 35.4, 45.8, 57.9% 감소하여 Th2 사이토카인을 억제함을 보여주었다(그림2 A). 또한, 혈청 및 림프에 존재하는 염증성 사이토카인의 분석결과IL-β, IL-4, IL-5, TNF-α, IL-17, IL-6, 및 CCL2(MCP-1)가 EBI 투여에 의해 상당히 줄어들었다(그림2 B 및 C). 따라서 EBI는 Th2 세포 관련 사이토카인의 발현을 억제시켜주며, 비만세포 침윤 및 IgE 생성 억제 등을 통해 아토피피부염 증상을 완화시키는 것으로 사료된다.
[그림2] OVA으로 유도된 사이토카인 발현억제에 대한 EBI의 효과
테라베스트의 본 특허에 따른 세포 조성물은 전체 세포 중 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상으로 증가된 것으로, 인터페론-감마를 지속적으로 생산하는 세포 비율이 증가함에 따라 아토피 피부염을 현저히 개선시킬 수 있다. 테라베스트는 현재 EBI를 이용한 중증도 아토피 피부염 치료제 임상 1/2a를 진행 중에 있다. 이에 부작용이 없고 안전하게 장기간 사용이 가능하여 아토피 피부염의 면역학적 이상을 근본적으로 치료할 수 있는 새로운 치료제의 개발이 기대된다.
특허법인 ECM
변리사 최자영
jychoi@ecmpatent.com
02-568-2675
참조
테라베스트 홈페이지
출원번호
10-2020-0031801
출원일자
2020년03월16일
출원인
(주) 테라베스트
공개번호(일자)
10-2020-0110253 (2020년09월23일)
발명의 명칭
세포 조성물, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 아토피 예방 또는 치료용 약학 조성물
아토피 피부염(atopic dermatitis)은 심한 소양증과 특징적인 피부 소견을 보이는 만성 염증성 질환이다. 유전적 배경, 면역학적 기전, 환경적 요인 등 다양한 인자로 이해 발병되는 것으로 알려져 있다. 가장 유력한 발병 기전에 대한 가설 중 하나는 Th1/Th2 세포의 항상성이 깨지면서 Th2 세포가 과활성되는 것이다. 특정 알레르겐 (allergen)에 의해 과활성화된 Th2 세포는 IL-4 및 IL-31 과 같은 Th2 사이토카인을 분비하고, 분비된 사이토카인은 B 세포의 IgE 분비와 비만세포 (Mast cell)의 탈과립을 유도하여 여러 염증 물질을 방출시킨다.
아토피 피부염에 현재까지는 항염증제인 코르티코스테로이드와 같은 물질을 사용하여 면역세포의 전반적인 활성을 억제시키는 방법을 사용하고 있을 뿐이며, 위 방법은 지속기간이 매우 짧을 뿐만 아니라 심한 부작용을 내포하고 있다. 또한, 최근 개발된 저분자 및 항체 치료제의 경우 한가지의 염증물질에 결합하는 수용체를 차단하는 수준이기 때문에 아토피와 같이 복잡한 염증 신호체계를 매개로 한 만성 피부염을 치료하기에는 한계가 있으며, 다른 경로를 통한 아토피 재발위험을 피하기 쉽지 않다.
최근에는 Th1 사이토카인의 일종인 IFN-γ 단백질을 이용하여 Th2 세포의 활성을 억제함으로써 아토피 피부염을 개선시키려는 시도들이 있었으나, IFN-γ 단백질은 체내 반감기가 극히 짧아 치료효과에 한계가 있다.
테라베스트의 본 특허는 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상인 세포 조성물에 관한 것으로, 아토피의 병인에 부합하여 Th1/Th2 면역체계 균형화를 통한 근본적인 치료 접근을 통해 치료효과를 극대화 시킬 수 있을 것으로 기대된다.
본 특허에 따른 세포 조성물은 인간의 말초혈액으로부터 단핵구 및 자가혈장을 각각 분리하여 수득하는 단계; 항-CD3 항체로 세포 배양용기를 코팅하는 단계; 및 상기 단핵구를 상기 세포 배양용기에 접종하여 IL-2, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조될 수 있다. 또한 제조된 총 세포 중 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60%이상인 것으로 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에서 체외증강 면역세포(Ex-vivo Boosted Imuune cell, EBI)를 배양하고, 이들 세포의 표현형을 분석한 결과, 인터페론-감마 및 NKG2D를 발현하는 세포의 비율이 매우 높으며, IL-4 및IL-13을 발현하는 세포의 비율이 낮아 아토피 피부염 예방 및 치료에 적합함을 확인하였다.
또한 OVA로 유도된 아토피피부염 개선에 대한 EBI의 효과를 분석한 결과, EBI를 투여한 군에서 피부병변 형태, 피부두께 등 아토피피부염의 임상적 특징이 개선되는 우수한 효과를 보였다.
정상마우스에 비하여 OVA로 유발된 대조군의 경우 피부장벽 붕괴 및 염증을 동반한 피부학적 증상 (건조, 홍반, 짓무름, 부종/혈종, 태선)과 표피두께가 심화된데 비해서 EBI를 투여한 실험군에서 증상들이 개선되는 효과를 보였다 (그림1A 내지 D). 이러한 평가 후 피부조직학적 개선효과를 알아보기 위하여 H&E로 피부조직을 염색하여 현미경으로 검경한 결과 OVA로 유발된 대조군은 정상군에 피해서 표피 두께와 피부장벽붕괴가 매우 증가되었다.
표피(epidermis)와 진피(dermis)가 부종으로 현저하게 확장되었고, epidermis의 탈락과 두께의 두꺼워짐을 확인할 수 있었다. 그러나 EBI를 투여한 군에서는 대조군에 비해서 피부조직학적 특징이 개선되는 효과를 보였다. 과각화증(hyperkeratosis), 이상각화증(parakeratosis)은 전반적으로 감소하였고, 표피(epidermis)의 두께도 줄어듬으로써 표피과다형성 (hyperplasia) 및 표피해면화 (spongiosis)도 줄어들었다. 또한 염증성 반응으로 두꺼워진 진피(dermis)의 두께도 얇아졌고, 퇴화되었던 모낭도 새로 형성되고 있음을 알 수 있다 (그림1 A,B).
또한 EBI를 투여한 군에서 대조군에 비해 아토피피부염의 심각성 정도(AD severity score)가 개선되었으며 (그림1 C), 긁는 행동이 상대적으로 감소하면서 소양감이 현저히 감소하였다 (그림1 D). 몸무게 변화를 측정하여 동물에 미치는 영향을 관찰한 결과, EBI 투여는 마우스의 체중에 영향을 주지 않았다 (그림1 E).
[그림1] OVA으로 유도된 아토피 모델에서 EBI의 개선효과
EBI의 알레르기 피부반응 및 IgE 억제 효과가 Th2 면역반응과 관련이 있는 지 확인하기 위해 OVA에 감작된 마우스로부터 피부조직을 분리하여 Th2 사이토카인의 mRNA 발현수준을 확인하였다. 실험결과, NOR군에 비해 OVA 처리군에서 Th2 분화유도 사이토카인 TSLP, IL-25, IL-33과 Th2 및 Th17 관련 사이토카인의 발현이 현저하게 증가하였다. 반면에 CsA 및 EBI 투여 마우스에서는 IL-4가 46.8%, IL-13이 47.3%, TSLP가 53.1%, IL-33이 49.2%가 감소하는 등 유의적으로 억제되었다. 양성대조군인 CsA처리군도 각각 33.6, 35.4, 45.8, 57.9% 감소하여 Th2 사이토카인을 억제함을 보여주었다(그림2 A). 또한, 혈청 및 림프에 존재하는 염증성 사이토카인의 분석결과IL-β, IL-4, IL-5, TNF-α, IL-17, IL-6, 및 CCL2(MCP-1)가 EBI 투여에 의해 상당히 줄어들었다(그림2 B 및 C). 따라서 EBI는 Th2 세포 관련 사이토카인의 발현을 억제시켜주며, 비만세포 침윤 및 IgE 생성 억제 등을 통해 아토피피부염 증상을 완화시키는 것으로 사료된다.
[그림2] OVA으로 유도된 사이토카인 발현억제에 대한 EBI의 효과
테라베스트의 본 특허에 따른 세포 조성물은 전체 세포 중 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상으로 증가된 것으로, 인터페론-감마를 지속적으로 생산하는 세포 비율이 증가함에 따라 아토피 피부염을 현저히 개선시킬 수 있다. 테라베스트는 현재 EBI를 이용한 중증도 아토피 피부염 치료제 임상 1/2a를 진행 중에 있다. 이에 부작용이 없고 안전하게 장기간 사용이 가능하여 아토피 피부염의 면역학적 이상을 근본적으로 치료할 수 있는 새로운 치료제의 개발이 기대된다.
특허법인 ECM
변리사 최자영
jychoi@ecmpatent.com
02-568-2675
참조
테라베스트 홈페이지